arrow



NО-синтаза

IFN индуцирует экспрессию одной из форм нитрооксидсинтазы (NOS). Этот фермент катализирует NADPН-зависимое окисление аргинина с образованием окиси азота и цитруллина (схема 4). Реакция протекает в две стадии. Первый этап реакции заключается в гидроксилировании аргинина с образованием промежуточного продукта - N-гидроксиаргинина, который на втором этапе окисляется в цитруллин и оксид азота, представляющий собой молекулу с неспаренным электроном, т. е. радикал. Известно три изоформы фермента: нейрональная (NOS1), выделенная первоначально из клеток нервной ткани (нейронов), индуцибельная (iNOS2), полученная из макрофагов, и эндотелиальная (NOS3), обнаруженная в эндотелии кровеносных сосудов.

 

Нейрональная и эндотелиальная NOS присутствуют в клетке постоянно и являются конститутивными белками, индуцибельная изоформа синтезируется в клетке в ответ на определенное внешнее воздействие, а именно цитокинов, энтеротоксинов и т. д. Нейрональная и макрофагальная формы NOS находятся в цитоплазме клеток, а эндотелиальная связана с мембранами клеток.

b_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza.jpg

Все нитрооксидсинтазы в активной форме являются гомодимерами, содержащими несколько доменов: N-концевой оксигеназный (остатки 1-498 для iNOS2), связывающий в качестве коферментов гем (железо протопорфирин IX) и тетрагидробиоптерин (ВН4), С-концевой редуктазный домен (остатки 531-1144 для iNOS2), гомологичный цитохром Р450 редуктазе и связывающий флавинмоно-нуклеотид (FMN), флавинадениндинуклеотид (FAD) и NADPН (рис. 4.23). Активность NOS зависит от внутриклеточной концентрации ионов кальция и кальмодулина и повышается под воздействием агентов, приводящих к увеличению их уровня в клетке. Поэтому в структуре NOS есть Са2+-связывающий домен (для нейрональной и эндотелиальной NOS), а в iNOS2 между оксигеназным и редуктазным доменами располагается сайт узнавания и взаимодействия с кальмодулином (СаМ), который связан с каждым мономером iNOS2 постоянно (остатки 499-530). Для образования активного димера необходимо сначала связывание с NOS коферментов - гема и тетрагидробиоптерина: в их отсутствие активный центр фермента не формируется и субстрат - аргинин с NOS не связывается.

Механизм функционирования NOS подобен механизму действия цитохрома Р450 и рассматривается на рис. 4.24. В присутствии ВН4 ион железа в геме находится в высокоспиновом состоянии I. Электрон, поступивший от FMNH2, восстанавливает железо в ион Fe2+ (состояние II), который способен взаимодействовать с молекулярным кислородом с образованием комплекса (IV) (это соединение может образовывать резонансную форму: Fe3+- супероксид-анион).

b_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza21.jpgb_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza22.jpg

Рис. 4.23. Доменная структура нитрооксидсинтаз (NOS): электроны от NADPH, связанным с редуктазным доменом NOS, через FAD и FMN поступают на коферменты оксигеназного домена - гем и тетрагидробиоптерин (ВН4). В активном центре, расположенном в оксигеназном домене, происходит окисление аргинина с образованием цитруллина и радикала нитрооксида (или нитроксиланиона - NO-). Образование активного димера имеет место только в присутствии ионов Са2+ или кальмодулина (СаМ), насыщенного ионами Са2+

Атом водорода от ВН4 восстанавливает супероксид-анион в гидро-пероксид (VI), протонирование которого вызывает разрыв связи кислород-кислород с образованием комплекса (VII) - Fe4+- катионный пи-радикал гема и белка (Р+"). Последнее соединение является высокоактивным окисляющим агентом, быстро гидроксилирующим аргинин по радикальному механизму с образованием N-гидроксиарги-нина и возвращающим гем в исходное состояние I (см. рис. 4.24 и схему 5, описывающие радикальный механизм реакции монооксигенации аргинина). Присоединение второй молекулы кислорода к гему на второй стадии реакции, катализируемой NOS, превращает N-гидроксиаргинин в цитруллин с отщеплением радикальной молекулы окиси азота (рис. 4.25).

b_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza3.jpg

Рис. 4.24. Механизм гидроксилирования аргинина с помощью NOS с образованием N-гидроксиаргинина. Ион железа в геме находится в высокоспиновом состоянии I. Электрон, перенесенный от FMNH2, восстанавливает железо в ион Fe2+ (состояние II), способный взаимодействовать с молекулярным кислородом с образованием комплекса IV, находящегося в резонансе с комплексом Fe3+- супероксид-анион. Атом водорода от ВН4 восстанавливает супероксид-анион в гидропероксид (VI), протонирование которого вызывает разрыв связи кислород-кислород с образованием комплекса (VII) - Fe4+- катионный радикал гема и белка (Р+"). Последнее соединение гидроксилирует аргинин с образованием N-гидроксиаргинина и возвращает гем в исходное состояние I.

b_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza4.jpg

В зависимости от доступности кофакторов и аргинина реакция может протекать: 1) с образованием NO; 2) с образованием пероксидов; 3) с одновременным образованием NO и пероксидов. При повышении уровня образования NO и cвободных радикалов создаются условия для синтеза пероксинитрита:

NO + H2O2 -> ONOO- + H+

При низких концентрациях пероксинитрит способен снижать агрегацию тромбоцитов, оказывая цитопротективное действие и являясь донором NO. При высоких концентрациях это соединение очень токсично, индуцирует апоптоз, нарушает функционирование системы простациклинсинтетазы, вызывает фрагментирование белков за счет нитрирования аминокислот и липопротеинов, индуцирует окисление Липопротеинов Низкой Плотности (ЛПНП).

Условия для синтеза ONOO- создаются при недостатке ВН4 в оксидазном домене NOS. В случае недостатка этого кофермента нарушается взаимосвязь между окислением кислорода и окислением аргинина. Результатом этого является окисление воды до перекиси водорода при низких концентрациях ВН4, синтез NO при высоких количествах кофактора и образование параллельных продуктов: Н2O2 и NO - при средних концентрациях тетрагидробиоптерина.

NO служит посредником при передаче паракринного сигнала. В нервной ткани это соединение выступает в качестве нейромедиатора. Оксид азота, синтезируемый эндотелиальной NOS, является важным компонентом регуляции тонуса кровеносных и лимфатических сосудов и предупреждает тромбообразование.

Кальций-независимая, индуцибельная NOS обнаружена в макро- фагах, гепатоцитах, фибробластах. Основные индукторы iNOS - воспалительные цитокины, эндотоксины, некоторые компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий, механическое повреждение сосудистой стенки, беременность. При активации индукторами образование NO в этих клетках возрастает в десятки раз. iNOS индуцируется также в зараженных вирусом клетках, где стимулирует образование нестабильных свободных радикалов, уровень которых коррелирует с развитием противовирусной активности макрофагов. В очагах воспаления под действием iNOS усиливается кровоток. Так как в структуре этой формы фермента отсутствует автоингибирующая последовательность, то фермент может синтезировать цитотоксические уровни NO.

Биохимической основой цитотоксичности NO является взаимодействие NO с ключевыми железосодержащими ферментами дыхательной цепи и синтеза ДНК, такими как аконитатгидратаза, NADH-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, рибонуклеозидредуктаза, в клетках-мишенях, в роли которых могут выступать раковые клетки, бактерии, грибы, гельминты.

b_300_300_16777215_0___images_stories_no-sintaza5.jpg

Рис. 4.25. Два возможных механизма второй стадии реакции, катализируемой NOS. А - нуклеофильный комплекс пероксид-железо, образованный связыванием Fe2+ с молекулярным кислородом и окислении N-гидроксиаргинина, атакует центральный углеродный атом радикала N-гидроксиаргинина и образует ковалентный интермедиат, распадающийся на NO и цитруллин. В - комплекс железо-пероксид распадается с образованием соединения, в котором железо окислено до валентности 4+ и которое реагирует с оксимом N-гидроксиаргинина с образованием оксазиридина. Последнее соединение распадается на NO и цитруллин.

Если вы живёте в Украине, караоке Одесса позволит приятно провести время с музыкой и пением.